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Capture coupling
작성: Hyeim Jeong
SPR 실험에서 고정화 방식은 크게 두 가지로 나눌 수 있습니다.
Amine coupling은 단백질에 존재하는 amine기를 이용하여 공유결합으로 센서칩 표면에 고정화합니다. 반면 capture 방식은 단백질의 tag과 특정 분자간의 친화도를 이용하여 고정화합니다. 이 두 가지 고정화 방식의 특징을 정리하면 아래와 같습니다.
적합한 고정화 방식은 ligand 또는 결합의 특성에 따라 결정됩니다. amine coupling은 가장 일반적이며 첫번째로 고려되어야 할 고정화 방식입니다. 그러나 방향성을 가진 고정화 방식이 아니기 때문에 결합 부위가 노출된 ligand는 전체 고정화 ligand에 비해 10%까지도 떨어질 수 있습니다. 반면 tag을 이용한 capture 방식은 하나의 방향으로 고정화됩니다. 결합 부위가 tag으로부터 멀리 떨어져있다면 효율적으로 결합 부위를 노출시킬 수 있습니다. 하지만 비공유 결합 방식이기 때문에 표면 안정성이 amine coupling에 비해 떨어진다는 단점이 있습니다. 이러한 각 고정화 방식의 단점을 보완할 수 있는 capture coupling 방식을 소개합니다.
Capture coupling 고정화
Capture coupling은 his-tag capture 방식과 amine coupling 방식이 결합된 고정화 방식으로 his-tag이 있는 ligand에 사용 가능합니다. NTA 센서칩에서 ligand가 his-tag 방향으로 ni-NTA와 비공유 결합을 형성한 후, EDC/NHS로 activation 된 NTA에 amine기와 공유 결합합니다.
ligand 결합 부위 노출 및 표면 안정성 증가
(A) Single cycle kinetic evaluation
(A)의 센서그램을 보면 ligand orientation이
되어있는 his-tag capture (red)와 capture coupling (blue)에서는 analyte 결합이 관찰됩니다. 이 두 가지 고정화 방식은 Kinetic 평가에서도 거의 같은 결합력을 가지는 것으로 평가되었습니다. 반면, amine coupling (green)에서는 ligand orientation이 되지 않아 analyte 결합이 관찰되지 않습니다.
Capture coupling은 his-tag capture보다 baseline drift가 약 5.2배 감소하여 표면 안정성도 높은 것을 알 수 있습니다. 이는 amine coupling으로 공유결합을 형성하여 ligand의 탈착을 막았기 때문입니다. 표면이 안정하기 때문에 매 analyte 사이클마다 ligand를 보충할 필요가 없으며, ligand에 따라 강한 regeneration 용액의 사용도 가능합니다.
(B) Baseline drift
SPR 분석에서 적합한 고정화 방식을 찾는 것은 좋은 데이터를 얻는 데에 꼭 필요한 과정입니다. Capture coupling은 특히 his-tag이 달린 ligand를 사용하여 높은 결합력을 갖는 저분자 분석에 굉장히 유용합니다.
*본 자료에 소개된 실험 방법에 대한 자세한 문의는 sales@icluebio.co.kr로 문의 주시기 바랍니다.
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